Protein er en væsentlig bestanddel af alle organismer. Hvert af dets molekyler består af en eller flere polypeptidkæder bestående af aminosyrer. Selvom den information, der er nødvendig for liv, er kodet i DNA eller RNA, udfører rekombinante proteiner en lang række biologiske funktioner i organismer, herunder enzymatisk katalyse, beskyttelse, støtte, bevægelse og regulering. I henhold til deres funktioner i kroppen kan disse stoffer opdeles i forskellige kategorier, såsom antistoffer, enzymer, strukturel komponent. På grund af deres vigtige funktioner er sådanne forbindelser blevet intensivt undersøgt og brugt i vid udstrækning.
Tidligere var den vigtigste måde at opnå et rekombinant protein på at isolere det fra en naturlig kilde, hvilket norm alt er ineffektivt og tidskrævende. Nylige fremskridt inden for biologisk molekylær teknologi har gjort det muligt at klone DNA, der koder for et specifikt sæt stoffer, til en ekspressionsvektor for stoffer som bakterier, gær, insektceller og pattedyrceller.
Simpelt sagt, rekombinante proteiner oversættes af eksogene DNA-produkter tillevende celler. At få dem involverer norm alt to hovedtrin:
- Kloning af et molekyle.
- Proteinudtryk.
I øjeblikket er produktionen af en sådan struktur en af de mest kraftfulde metoder, der bruges inden for medicin og biologi. Sammensætningen har en bred anvendelse inden for forskning og bioteknologi.
Medicinsk vejledning
Rekombinante proteiner giver vigtige behandlinger for forskellige sygdomme såsom diabetes, cancer, infektionssygdomme, hæmofili og anæmi. Typiske formuleringer af sådanne stoffer omfatter antistoffer, hormoner, interleukiner, enzymer og antikoagulanter. Der er et voksende behov for rekombinante formuleringer til terapeutisk anvendelse. De giver dig mulighed for at udvide behandlingsmetoder.
genetisk manipulerede rekombinante proteiner spiller en nøglerolle på det terapeutiske lægemiddelmarked. Pattedyrceller producerer i øjeblikket de mest terapeutiske midler, fordi deres formuleringer er i stand til at producere naturligt-lignende stoffer af høj kvalitet. Derudover produceres mange godkendte rekombinante terapeutiske proteiner i E. coli på grund af god genetik, hurtig vækst og høj produktivitet. Det har også en positiv effekt på udviklingen af lægemidler baseret på dette stof.
Forskning
Opnåelse af rekombinante proteiner er baseret på forskellige metoder. Stoffer hjælper med at finde ud af kroppens grundlæggende og grundlæggende principper. Disse molekyler kan bruges til at identificere og bestemmeplacering af stoffet kodet af et bestemt gen, og at afsløre funktionen af andre gener i forskellige cellulære aktiviteter såsom cellesignalering, metabolisme, vækst, replikation og død, transkription, translation og modifikation af forbindelserne diskuteret i artiklen.
Den observerede sammensætning bruges derfor ofte i molekylærbiologi, cellebiologi, biokemi, strukturelle og biofysiske undersøgelser og mange andre videnskabsområder. Samtidig er opnåelse af rekombinante proteiner en international praksis.
Sådanne forbindelser er nyttige værktøjer til at forstå intercellulære interaktioner. De har vist sig effektive i flere laboratoriemetoder såsom ELISA og immunhistokemi (IHC). Rekombinante proteiner kan bruges til at udvikle enzymassays. Når de bruges i kombination med et par passende antistoffer, kan celler bruges som standarder for nye teknologier.
Bioteknologi
Rekombinante proteiner, der indeholder en aminosyresekvens, bruges også i industri, fødevareproduktion, landbrug og bioteknik. Inden for dyrehold kan enzymer f.eks. tilsættes fødevarer for at øge næringsværdien af foderingredienser, reducere omkostninger og spild, understøtte dyrenes tarmsundhed, forbedre produktiviteten og forbedre miljøet.
Derudover mælkesyrebakterier (LAB) i lang tider blevet brugt til at producere fermenterede fødevarer, og for nylig er LAB blevet udviklet til ekspression af rekombinante proteiner indeholdende en aminosyresekvens, som kan bruges i vid udstrækning, for eksempel til at forbedre menneskers, dyrs og ernæringsmæssige fordøjelse.
Disse stoffer har dog også begrænsninger:
- I nogle tilfælde er produktionen af rekombinante proteiner kompleks, dyr og tidskrævende.
- Stoffer produceret i celler matcher muligvis ikke naturlige former. Denne forskel kan reducere effektiviteten af terapeutiske rekombinante proteiner og endda forårsage bivirkninger. Derudover kan denne forskel påvirke resultaterne af eksperimenter.
- Hovedproblemet med alle rekombinante lægemidler er immunogenicitet. Alle bioteknologiske produkter kan udvise en form for immunogenicitet. Det er svært at forudsige sikkerheden af nye terapeutiske proteiner.
Generelt har fremskridt inden for bioteknologi øget og lettet produktionen af rekombinante proteiner til en række forskellige anvendelser. Selvom de stadig har nogle ulemper, er stofferne vigtige inden for medicin, forskning og bioteknologi.
sygdomslink
rekombinant protein er ikke skadeligt for mennesker. Det er kun en integreret del af det samlede molekyle i udviklingen af et bestemt lægemiddel eller ernæringselement. Mange medicinske undersøgelser har vist, at tvungen ekspression af FGFBP3-proteinet (forkortet BP3) i en laboratoriestamme af fede mus viste en signifikant reduktion i deres kropsfedt.masse, på trods af den genetiske disposition for at bruge.
Resultaterne af disse forsøg viser, at FGFBP3-proteinet kan tilbyde en ny behandling for lidelser forbundet med metabolisk syndrom, såsom type 2-diabetes og fedtleversygdom. Men fordi BP3 er et naturligt protein og ikke et kunstigt lægemiddel, kunne kliniske forsøg med rekombinant humant BP3 begynde efter den sidste runde af prækliniske undersøgelser. På, det vil sige, at der er grunde relateret til sikkerheden ved at udføre sådanne undersøgelser. Det rekombinante protein er ikke skadeligt for mennesker på grund af dets trinvise forarbejdning og oprensning. Ændringer finder også sted på molekylært niveau.
PD-L2, en af nøglespillerne inden for immunterapi, blev nomineret til 2018 Nobelprisen i fysiologi eller medicin. Dette arbejde, startet af prof. James P. Allison fra USA og prof. Tasuku Honjo fra Japan, har ført til behandling af kræftformer såsom melanom, lungekræft og andre baseret på checkpoint immunterapi. For nylig har AMSBIO tilføjet et stort nyt produkt til sin immunterapilinje, PD-L2/TCR-aktivatoren - CHO Recombinant Cell Line.
I proof-of-concept eksperimenter, forskere ved University of Alabama i Birmingham, ledet af H. Long Zheng, MD, professor Robert B. Adams og direktør for Laboratory Medicine, Department of Pathology, UAB School of Medicin, har fremhævet en potentiel behandling, en sjælden, men dødelig blødningssygdom, TTP.
Resultaterne af detteundersøgelser viser for første gang, at transfusion af rADAMTS13-ladede blodplader kan være en ny og potentielt effektiv terapeutisk tilgang til arteriel trombose forbundet med medfødt og immunmedieret TTP.
Rekombinant protein er ikke kun et næringsstof, men også et lægemiddel i sammensætningen af det lægemiddel, der udvikles. Dette er blot nogle få områder, der nu er involveret i medicin og relateret til studiet af alle dets strukturelle elementer. Som international praksis viser, gør strukturen af et stof det muligt på molekylært niveau at håndtere mange alvorlige problemer i den menneskelige krop.
Vaccineudvikling
Et rekombinant protein er et specifikt sæt af molekyler, der kan modelleres. En lignende egenskab bruges i udviklingen af vacciner. En ny vaccinationsstrategi, også kendt som brugen af en speciel rekombinant virusinjektion, kunne beskytte millioner af kyllinger i fare for en alvorlig luftvejssygdom, sagde forskere fra University of Edinburgh og Pirbright Institute. Disse vacciner bruger harmløse eller svage versioner af en virus eller bakterie til at indføre bakterier i kroppens celler. I dette tilfælde brugte eksperter rekombinante vira med forskellige spidsproteiner som vacciner til at skabe to versioner af en harmløs virus. Der er mange forskellige stoffer bygget op omkring denne forbindelse.
Rekombinant protein handelsnavne og analoger er som følger:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Dette er hovedsagelig lægemidler mod kræft, men der er andre behandlingsområder forbundet med dette aktive stof.
En ny vaccine, også kaldet LASSARAB, designet til at beskytte mennesker mod både Lassa-feber og rabies, har vist lovende resultater i prækliniske undersøgelser, ifølge en ny undersøgelse offentliggjort i det videnskabelige tidsskrift Nature Communications. En inaktiveret rekombinant vaccinekandidat bruger en svækket rabiesvirus.
Forskerholdet indsatte Lassa-virus genetisk materiale i en rabiesvirusvektor, så vaccinen kunne udtrykke overfladeproteiner i både Lassa- og rabiesceller. Disse overfladeforbindelser fremkalder et immunrespons mod infektiøse stoffer. Denne vaccine blev derefter inaktiveret for at "ødelægge" den levende rabiesvirus, der blev brugt til at fremstille bæreren.
Få metoder
Der er flere systemer til fremstilling af et stof. Den generelle fremgangsmåde til opnåelse af et rekombinant protein er baseret på opnåelse af biologisk materiale fra syntesen. Men der er andre måder.
I øjeblikket er der fem hovedudtrykssystemer:
- E. coli-ekspressionssystem.
- Gærekspressionssystem.
- Insektcelleekspressionssystem.
- Pattedyrs celleekspressionssystem.
- Cellefrit proteinekspressionssystem.
Sidstnævnte mulighed er særligt velegnet til ekspression af transmembrane proteinerog giftige forbindelser. I de senere år er stoffer, der er svære at udtrykke ved konventionelle intracellulære metoder, med succes blevet integreret i celler in vitro. I Hviderusland er produktionen af rekombinante proteiner meget brugt. Der er en række statsejede virksomheder, der beskæftiger sig med dette problem.
Cell Free Protein Synthesis System er en hurtig og effektiv metode til at syntetisere målstoffer ved at tilføje forskellige substrater og energiforbindelser, der er nødvendige for transkription og translation i det enzymatiske system af cellulære ekstrakter. I de senere år er fordelene ved cellefri metoder til typer af stoffer som komplekse, giftige membraner gradvist dukket op, hvilket viser deres potentielle anvendelse på det biofarmaceutiske område.
Cellefri teknologi kan tilføje en række ikke-naturligt forekommende aminosyrer nemt og på en kontrolleret måde for at opnå komplekse modifikationsprocesser, der er svære at løse efter konventionel rekombinant ekspression. Sådanne metoder har høj anvendelsesværdi og potentiale for lægemiddellevering og vaccineudvikling ved anvendelse af viruslignende partikler. Et stort antal membranproteiner er med succes blevet udtrykt i frie celler.
Udtryk for kompositioner
Rekombinant protein CFP10-ESAT 6 produceres og bruges til at skabe vacciner. Et sådant tuberkuloseallergen giver dig mulighed for at styrke immunsystemet og udvikle antistoffer. Generelt involverer molekylære undersøgelser studiet af ethvert aspekt af et protein, såsom struktur, funktion, modifikationer, lokalisering eller interaktioner. At udforskehvordan specifikke stoffer regulerer interne processer, kræver forskere norm alt midlerne til at producere funktionelle forbindelser af interesse og gavn.
I betragtning af størrelsen og kompleksiteten af proteiner er kemisk syntese ikke en levedygtig mulighed for denne bestræbelse. I stedet bliver levende celler og deres cellulære maskineri norm alt brugt som fabrikker til at skabe og konstruere stoffer baseret på de medfølgende genetiske skabeloner. Det rekombinante proteinekspressionssystem genererer derefter den nødvendige struktur til at skabe et lægemiddel. Dernæst kommer udvælgelsen af det nødvendige materiale til forskellige kategorier af lægemidler.
I modsætning til proteiner er DNA let at konstruere syntetisk eller in vitro ved hjælp af veletablerede rekombinante teknikker. Derfor kan DNA-skabeloner af specifikke gener, med eller uden tilføjede reportersekvenser eller affinitetsmærkesekvenser, designes som skabeloner til ekspression af det overvågede stof. Sådanne forbindelser afledt af sådanne DNA-skabeloner kaldes rekombinante proteiner.
Traditionelle strategier til ekspression af et stof involverer transficering af celler med en DNA-vektor, der indeholder en skabelon, og derefter dyrkning af cellerne for at transkribere og oversætte det ønskede protein. Typisk lyseres cellerne derefter for at ekstrahere den udtrykte forbindelse til efterfølgende oprensning. Det rekombinante protein CFP10-ESAT6 bearbejdes på denne måde og gennemgår et oprensningssystem fra evt.dannelsen af toksiner. Først derefter skal det syntetiseres til en vaccine.
Både prokaryote og eukaryote in vivo-ekspressionssystemer for molekylære stoffer er meget brugt. Valget af system afhænger af typen af protein, kravet til funktionel aktivitet og det ønskede udbytte. Disse ekspressionssystemer omfatter pattedyr, insekter, gær, bakterier, alger og celler. Hvert system har sine egne fordele og udfordringer, og valget af det rigtige system til en bestemt anvendelse er vigtigt for en vellykket udtryk for det stof, der er under revision.
Udtryk fra pattedyr
Brugen af rekombinante proteiner tillader udvikling af vacciner og lægemidler på forskellige niveauer. Til dette kan denne metode til at opnå et stof bruges. Pattedyrs ekspressionssystemer kan bruges til at producere proteiner fra dyreriget, som har den mest native struktur og aktivitet på grund af deres fysiologisk relevante miljø. Dette resulterer i høje niveauer af post-translationel behandling og funktionel aktivitet. Pattedyrsekspressionssystemer kan anvendes til at producere antistoffer, komplekse proteiner og forbindelser til anvendelse i cellebaserede funktionelle assays. Disse fordele er dog kombineret med strengere kulturbetingelser.
Pattedyrsekspressionssystemer kan bruges til at generere proteiner forbigående eller gennem stabile cellelinjer, hvor ekspressionskonstruktionen er integreret i værtsgenomet. Mens sådanne systemer kan bruges i flere eksperimenter, er tidenproduktion kan generere en stor mængde stof på en til to uger. Denne type rekombinant proteinbioteknologi er meget efterspurgt.
Disse forbigående, højtydende pattedyrsekspressionssystemer bruger suspensionskulturer og kan give gram pr. liter. Derudover har disse proteiner mere naturlig foldning og post-translationelle modifikationer såsom glykosylering sammenlignet med andre ekspressionssystemer.
Insektudtryk
Metoder til fremstilling af rekombinant protein er ikke begrænset til pattedyr. Der er også mere produktive måder med hensyn til produktionsomkostninger, selvom udbyttet af stoffet pr. 1 liter behandlet væske er meget lavere.
Insektceller kan bruges til at udtrykke et protein på højt niveau med modifikationer, der ligner pattedyrsystemer. Der er flere systemer, der kan bruges til at generere rekombinant baculovirus, som derefter kan bruges til at udtrække stoffet af interesse i insektceller.
Udtryk af rekombinante proteiner kan let skaleres op og tilpasses til suspensionskulturer med høj densitet til sammensætning af molekyler i stor skala. De ligner mere funktionelt den native sammensætning af pattedyrsstof. Selvom udbyttet kan være op til 500 mg/L, kan produktionen af rekombinant baculovirus være tidskrævende, og dyrkningsbetingelser er vanskeligere end prokaryote systemer. Men i mere sydlige og varmere lande, en lignendemetode anses for at være mere effektiv.
Bakterieudtryk
Produktion af rekombinante proteiner kan etableres ved hjælp af bakterier. Denne teknologi er meget forskellig fra dem, der er beskrevet ovenfor. Bakterielle proteinekspressionssystemer er populære, fordi bakterierne er nemme at dyrke, vokser hurtigt og giver høje udbytter af den rekombinante formulering. Imidlertid er eukaryote stoffer med flere domæner udtrykt i bakterier ofte ikke-funktionelle, fordi celler ikke er udstyret til at udføre de nødvendige post-translationelle modifikationer eller molekylær foldning.
Derudover bliver mange proteiner uopløselige som inklusionsmolekyler, som er meget svære at genvinde uden skrappe denaturatorer og efterfølgende besværlige molekylære genfoldningsprocedurer. Denne metode anses for det meste stadig i vid udstrækning at være eksperimentel.
Cellfrit udtryk
Rekombinant protein indeholdende aminosyresekvensen af staphylokinase opnås på en lidt anderledes måde. Det er inkluderet i mange typer injektioner, der kræver flere systemer før brug.
Cellefri proteinekspression er en in vitro-syntese af et stof ved hjælp af translationelt kompatible helcelleekstrakter. I princippet indeholder helcelleekstrakter alle de makromolekyler og komponenter, der kræves til transkription, translation og endda post-translationel modifikation.
Disse komponenter omfatter RNA-polymerase, regulatoriske proteinfaktorer, transkriptionsformer, ribosomer og tRNA. Ved tilføjelsecofaktorer, nukleotider og en specifik genskabelon, kan disse ekstrakter syntetisere proteiner af interesse på få timer.
Selv om det ikke er bæredygtigt for produktion i stor skala, tilbyder cellefri eller in vitro proteinekspression (IVT) systemer en række fordele i forhold til konventionelle in vivo-systemer.
Cellefri ekspression tillader hurtig syntese af rekombinante formuleringer uden at involvere cellekultur. Cellefrie systemer gør det muligt at mærke proteiner med modificerede aminosyrer, samt at udtrykke forbindelser, der undergår hurtig proteolytisk nedbrydning af intracellulære proteaser. Derudover er det lettere at udtrykke mange forskellige proteiner på samme tid ved hjælp af en cellefri metode (f.eks. testning af proteinmutationer ved småskala-ekspression fra mange forskellige rekombinante DNA-skabeloner). I dette repræsentative eksperiment blev IVT-systemet brugt til at udtrykke det humane caspase-3-protein.
Konklusioner og fremtidsudsigter
Rekombinant proteinproduktion kan nu ses som en moden disciplin. Dette er resultatet af adskillige trinvise forbedringer i oprensning og analyse. I øjeblikket stoppes lægemiddelopdagelsesprogrammer sjældent på grund af manglende evne til at producere målproteinet. Parallelle processer til ekspression, oprensning og analyse af adskillige rekombinante stoffer er nu velkendte i mange laboratorier rundt om i verden.
Proteinkomplekser og voksende succes i fremstillingensolubiliserede membranstrukturer vil kræve flere ændringer for at holde trit med efterspørgslen. Fremkomsten af effektive kontraktforskningsorganisationer for en mere regelmæssig forsyning af proteiner vil muliggøre omfordeling af videnskabelige ressourcer for at imødegå disse nye udfordringer.
Derudover bør parallelle arbejdsgange give mulighed for oprettelse af komplette biblioteker af det overvågede stof for at muliggøre ny målidentifikation og avanceret screening sammen med traditionelle lægemiddelopdagelsesprojekter med små molekyler.
