Molekylærbiologiske forskningsmetoder spiller en stor rolle i moderne medicin, retsmedicin og biologi. Takket være fremskridt i studiet af DNA og RNA er en person i stand til at studere genomet af en organisme, bestemme årsagen til en sygdom, genkende den ønskede nukleinsyre i en blanding af syrer osv.
Molekylærbiologiske forskningsmetoder. Hvad er det?
Tilbage i 70'erne og 80'erne lykkedes det for første gang forskerne at tyde det menneskelige genom. Denne begivenhed satte skub i udviklingen af genteknologi og molekylærbiologi. Studiet af egenskaberne ved DNA og RNA har ført til, at det nu er muligt at bruge disse nukleinsyrer til at diagnosticere en sygdom, studere gener.
Opnåelse af DNA og RNA
Molekylærbiologiske diagnostiske metoder kræver tilstedeværelsen af udgangsmateriale: oftere er det nukleinsyrer. Der er flere måder at isolere disse stoffer fra cellerne i levende organismer. Hver af dem har sine egne fordele og ulemper, og det er nødvendigttages i betragtning, når du vælger en metode til isolering af rene nukleinsyrer.
1. Indhentning af DNA ifølge Marmur. Metoden består i at behandle en blanding af stoffer med alkohol, hvorved der udfældes rent DNA. Ulempen ved denne metode er brugen af aggressive stoffer: phenol og chloroform.
2. Isolering af DNA ifølge Boom. Det vigtigste stof, der anvendes her, er guanidinthiocyanat (GuSCN). Det bidrager til udfældningen af deoxyribonukleinsyre på specialiserede substrater, hvorfra det efterfølgende kan opsamles ved hjælp af en speciel buffer. GuSCN er dog en hæmmer af PTC, og selv en lille del af det, der kommer ind i det præcipiterede DNA, kan påvirke forløbet af polymerasekædereaktionen, som spiller en vigtig rolle i arbejdet med nukleinsyrer.
3. Sedimentering af urenheder. Metoden adskiller sig fra de foregående ved, at det ikke er molekylerne af deoxyribonukleinsyre, der udfældes, men urenheder. For at gøre dette bruges ionbyttere. Ulempen er, at ikke alle stoffer kan udfældes.
4. Massescreening. Denne metode bruges i de tilfælde, hvor nøjagtig information om DNA-molekylets sammensætning ikke er nødvendig, men det er nødvendigt at indhente nogle statistiske data. Dette forklares ved, at strukturen af nukleinsyren kan blive beskadiget, når den behandles med detergenter, især alkalier.
Klassificering af forskningsmetoder
Alle molekylærbiologiske forskningsmetoder er opdelt i tre store grupper:
1. Amplifikation (ved hjælp af mange enzymer). Herhenviser til PCR - polymerasekædereaktion, som spiller en stor rolle i mange af de diagnostiske metoder.
2. Ikke-forstærkende. Denne gruppe af metoder er direkte relateret til driften af blandinger af nukleinsyrer. Eksempler er 3 blots, in situ hybridisering osv.
3. Metoder baseret på genkendelse af et signal fra et probemolekyle, der binder til et specifikt probe-DNA eller RNA. Et eksempel er Hybride Capture System (hc2).
Enzymer, der kan bruges i molekylærbiologiske forskningsmetoder
Mange molekylære diagnostiske metoder involverer brugen af en lang række enzymer. Nedenfor er de mest brugte:
1. Restriktionsenzym - "skærer" DNA-molekylet i de nødvendige dele.
2. DNA-polymerase - syntetiserer et dobbeltstrenget molekyle af deoxyribonukleinsyre.
3. Revers transkriptase (revertase) - bruges til at syntetisere DNA på en RNA-skabelon.
4. DNA-ligase - ansvarlig for dannelsen af phosphodiesterbindinger mellem nukleotider.
5. Exonuklease - fjerner nukleotider fra de terminale sektioner af deoxyribonukleinsyremolekylet.
PCR er hovedmetoden til DNA-amplifikation
Polymerase-kædereaktion (PCR) bruges aktivt i moderne molekylærbiologi. Dette er en metode, hvor et stort antal kopier kan opnås fra et enkelt DNA-molekyle (molekyler amplificeres).
PCR-hovedfunktioner:
- diagnostiksygdomme;
- kloning af DNA-segmenter, gener.
Følgende elementer er nødvendige for at udføre en polymerasekædereaktion: det indledende DNA-molekyle, en termostabil DNA-polymerase (Taq eller Pfu), deoxyribonukleotidphosphater (kilder til nitrogenholdige baser), primere (2 primere pr. 1 DNA-molekyle)) og selve buffersystemet, hvor alle reaktioner er mulige.
PCR består af tre trin: denaturering, primer-annealing og forlængelse.
1. Denaturering. Ved en temperatur på 94-95 grader Celsius brydes hydrogenbindingerne mellem de to DNA-strenge, og som et resultat får vi to enkeltstrengede molekyler.
2. Primer udglødning. Ved en temperatur på 50-60 grader Celsius fæstnes primere til enderne af enkeltstrengede nukleinsyremolekyler ved typen af komplementaritet.
3. Forlængelse. Ved en temperatur på 72 grader sker syntesen af datter-dobbeltstrengede molekyler af deoxyribonukleinsyre.
DNA-sekventering
Molekylærbiologiske forskningsmetoder kræver ofte viden om nukleotidsekvensen i et deoxyribonukleinsyremolekyle. Sekventering udføres for at bestemme den genetiske kode. Fremtidens molekylære diagnostik vil være baseret på viden opnået fra menneskelig sekventering.
Der skelnes mellem følgende typer sekventering:
- Maxam-Gilbert-sekventering;
- Sanger-sekventering;
- pyrosequencing;
- nanoporesekventering.
