Dyrkning af bakterier: metoder, principper, trin og betingelser

2024 Forfatter: Angel Austin | [email protected]. Sidst ændret: 2023-12-17 05:21

Mikroorganismer i naturen omkring os er over alt: I jord, vandområder, på overfladen af forskellige objekter, er mennesker og dyr beboet af dem. Alt dette kan tjene som kilder til mikrobiel kontaminering af fødevarer, lægemidler og produktionslinjer. Dyrkning af bakterier er nødvendig for at studere deres egenskaber, behov og egenskaber. Dette er igen et vigtigt skridt i udviklingen af forskellige lægemidler, laboratoriediagnostik af sygdomme, beregning af produktionsreaktorer og meget mere.

Generelle begreber

Dyrkning af bakterier i mikrobiologi refererer til dyrkning af mikroorganismer udført i laboratoriet. Til gengæld kaldes mikrober, der er vokset på et udvalgt næringsmedium, en kultur. Kulturer kan blandes, hvis de er dannet af forskellige typer mikroorganismer, og rene, hvis de kun er repræsenteret af én type bakterier.

Hvis ernæringsmæssigtKun én celle er placeret i mediet, og en gruppe individer opnås som et resultat af dens reproduktion, så kaldes dette sæt af mikroorganismer en klon. Når en klon udvikler sig til det punkt, hvor den bliver synlig for det blotte øje, kaldes denne samling af bakterier en koloni.

Sædvanligvis udføres dyrkning af bakterier isoleret fra forskellige kilder separat fra hinanden. Hver sådan separat dyrket gruppe af mikrober kaldes en stamme. Så hvis en type stafylokokker er isoleret fra tre kilder (eller forskellige dele af det samme produkt, forskellige mennesker), taler de om tre stammer af denne type stafylokokker.

Bakterievækstfaktorer

Disse omfatter forskellige aminosyrer, lipider, purinbaser og andre forbindelser, der er nødvendige for udviklingen af mikroorganismer. Nogle mikrober kan selvstændigt producere de stoffer, de har brug for, mens andre skal modtage dem i færdig form. I henhold til mikroorganismernes behov i visse vækstfaktorer udføres identifikation og differentiering af bakterier. Denne parameter er også vigtig for den korrekte forberedelse af et næringsmedium til laboratorie- og bioteknologisk arbejde:

• Aminosyrer. Bakterier kan kræve en bestemt aminosyre eller gruppe af syrer. Så clostridier har brug for leucin og tyrosin, streptokokker har brug for leucin og arginin. Mikroorganismer, der kræver aminosyrer udefra for at vokse, kaldes auxotrofer.
• Purin- og pyrimidinbaser, såvel som deres derivater (adenin, guanin og andre). De er en vigtig faktor i manges vækstStreptococcus arter.
• Vitaminer. De er en del af de coenzymer, der kræves af bakterier. Så nikotinsyre, såvel som dets amid, som er en del af NAD og NADP, er påkrævet af difteri og shigella corynebacteria. Thiamin, som en integreret del af pyrophosphat, kræves af Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Pantothensyre, som er en del af CoA-coenzymet, er påkrævet af stivkrampebaciller og visse typer streptokokker. Cytokromer og derfor folinsyre, hæm og biotin, der danner dem, er nødvendige for Mycobacterium tuberculosis og Haemophilus influenzae.

Miljøkrav

Betingelser for dyrkningsmedier til dyrkning af bakterier:

1. Ernæring. De skal desuden indeholde stoffer i letfordøjelig form, som er nødvendige for, at mikroorganismer kan fodre og genopbygge energi. Disse omfatter organogener og mineraler. Nogle mikroorganismer kræver desuden vitaminer og aminosyrer, som de ikke kan syntetisere.
2. Optim alt pH-niveau. Det påvirker permeabiliteten af cellemembranen og dermed evnen til at optage næringsstoffer af bakterien. Oftest skal pH-værdien ligge på niveauet 7, 2–7, 4. Mange mikroorganismer producerer i løbet af deres liv produkter med sure eller basiske reaktioner, og for at pH i næringsmediet ikke skal ændre sig, den skal bufres.
3. Isotonisk. Det osmotiske tryk i næringsmediet til dyrkning af bakterier bør have samme værdier sominde i mikrobielle celler. Det svarer norm alt til en 0,5 % NaCl-opløsning.
4. Sterilitet. Dette skyldes, at fremkomsten af fremmede bakterier vil forvrænge resultaterne af undersøgelsen af den analyserede stamme.
5. Fugtighedsniveau. Denne indikator bør sammen med mediets konsistens have optimale egenskaber for en bestemt type bakterier.
6. Redox-potentiale (RH2). Det viser forholdet mellem stoffer, der donerer og accepterer elektroner, samt niveauet af iltmætning af næringsmediet. For aerobe og anaerobe er betingelserne for at dyrke bakterier noget forskellige i denne indikator. Anaerobe mikroorganismer reproducerer bedst ved RH2-værdier under 5 og aerobe mikroorganismer ved mindst 10.
7. Ensartethed. Det er vigtigt, at dyrkningsmediet indeholder konstante mængder af dets individuelle ingredienser. Derudover foretrækkes klare løsninger, som gør det nemmere at overvåge afgrødevækst eller bemærke forurening.

Typer af kulturmedier

Valget af et bestemt medium til dyrkning af mikroorganismer er påvirket af mange faktorer, blandt dem er egenskaberne ved deres ernæring og formålet med undersøgelsen. De vigtigste funktioner, der ligger til grund for klassificeringen af næringsmedier, er:

1. Komponenter. Ifølge de oprindelige stoffer, der bruges til at skabe substratet, skelner de mellem:

• naturlig, som er fremstillet af produkter af animalsk eller vegetabilsk oprindelse (f.eks. kød, mælk, frugt) og er velegnet til at dyrke blandetafgrøder;
• halvsyntetisk, hvor dyre naturlige fødevarer erstattes af non-food produkter (f.eks. knoglemel, blodpropper), og som er optimale til at dyrke visse typer bakterier eller isolere deres stofskifteprodukter fra miljø;
• syntetisk, som er fremstillet af præcise mængder af kemiske forbindelser, har en kendt konstant sammensætning og er let reproducerbare.

2. Konsistens (densitet). Skeln mellem miljøer:

• væske;
• tæt;
• semi-flydende.

De sidste to er fremstillet af specielle opløsninger eller flydende stoffer med tilsætning af agar-agar eller gelatine for at skabe den nødvendige tæthed. Derudover er et tæt miljø for vækst af bakterier størknet blodserum, kartofler, silicagelmedier, carrageenan.

3. Forbindelse. På dette grundlag er miljøerne:

• simple, hvis liste er kort er Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), næringsgelatine og peptonvand.
• kompleks, fremstillet af simple med tilsætning af blod, valle, kulhydrater og andre stoffer.

4. Aftale. Der skelnes mellem følgende næringsmedier:

• main bruges til at dyrke mange patogene mikrober (norm alt simpel sammensætning);
• specielle bruges til at isolere og dyrke bakterier, der ikke vokser på simple substrater;
• selektive (de er også selektive) er velegnede til at isolere en specifik type bakterier og hæmmer væksten af associerede mikrober (selektivitetskabt ved at tilsætte bestemte stoffer til mediet, såsom antibiotika eller s alte, eller ved at justere pH);
• differentialdiagnostik gør det muligt at skelne en type bakterier fra en anden ved at vurdere den enzymatiske aktivitet, f.eks. af mediet;
• konserveringsmidler er nødvendige til indledende podning med efterfølgende transport af prøver, da de forhindrer mikroorganismers død, samt hæmmer væksten af andre bakterier.

Medieforberedelse

Det vigtigste trin i dyrkningen af anaerobe bakterier er forberedelsen af et passende næringsmedium. Når de optimale parametre er valgt, skal du fortsætte til følgende trin:

• vejning, ved at vælge en prøve af komponenter på en analytisk vægt;
• opløsning udføres i destilleret vand opvarmet til 70 °C, og fosfater, mikro- og makros alte opløses separat;
• kogning i vandbad i to minutter;
• pH-bestemmelse med indikatorpapir eller potentiometer;
• filtrering gennem våd klud eller papirfiltre til flydende såvel som smeltede tætte medier og gennem et bomuldsgazefilter til agarmedier;
• aftapning udført på 3/4 kapacitet;
• medium afhængig sterilisation;
• kontrol for sterilitet udføres ved at sætte sig i to dage i en termostat, efterfulgt af visning;
• kemisk kontrol for at etablere pH og indhold af det nødvendigevarer;
• biologisk kontrol ved prøvepodning.

Sterilisering af glasvarer og medier

Et af de grundlæggende principper for bakteriedyrkning er sterilitet. Væksten og udviklingen af fremmede mikroorganismer kan påvirke næringsmediets egenskaber ved at ændre dets kemiske sammensætning og pH. Sterilisering er hovedbetingelsen for at dyrke renkulturer. I praksis betyder dette udtryk metoderne til ødelæggelse af absolut alle livsformer på overfladen og i volumen af steriliserede genstande. Kar, brugte instrumenter, medier og andre genstande, der blev brugt under undersøgelsen, steriliseres.

Nogle typer sterilisering:

• Tænding. Sterilisering af løkker og nåle til såning, glasglas, nogle instrumenter kan udføres ved hjælp af en brænder eller spritlampe.
• Kogende. Velegnet til håndtering af sprøjter, nåle, mad, men dræber ikke bakteriesporer.
• Tørvarmesterilisering. Den udføres i et specielt tørreskab og er velegnet til behandling af kolber, reagensglas og andet laboratorieglas.
• Dampsterilisering. Udført i en autoklave er denne metode yderst effektiv. Men det er ikke egnet til næringsmedier, der indeholder proteiner eller andre forbindelser, der nedbrydes ved høje temperaturer. Mere sparsomt kan man kalde tyndalisering. Det udføres i Koch-kedlen og kombinerer spiring af sporer med deres ødelæggelse.
• Pasteurisering. Det bruges til medier, der ændrer deres egenskaber, når de koges (for eksempel mælk, vin, øl), i stand tilbefri dem for ikke-spore-bærende mikroorganismer. Forarbejdningstemperaturen er kun 50-60 ° C i femten til tredive minutter. I nogle tilfælde anvendes koldsterilisering, udført ved hjælp af filtre eller UV-stråler.

Bakteriedyrkningsbetingelser

Vækst og udvikling af bakterier er kun mulig under visse faktorer og værdierne for hver af dem:

1. Temperatur. Der er tre grupper af bakterier, der adskiller sig i temperaturpræferencer:

• termofiler, eller varmeelskende mikrober, vokser ved 45-90°C, hvilket betyder, at de ikke formerer sig i menneske- og dyreorganismer;
• psykrofiler eller kuldeelskende mikroorganismer foretrækker temperaturer i området 5-15 °C og dyrkes i kølehuse;
• mesofiler, udvikler sig ved en temperatur på 25-37 °C, de omfatter hovedparten af bakterier.

2. Lys. Det er et træk ved dyrkningen af fototrofiske bakterier, da de udfører den fotosyntetiske proces. Men for de fleste mikrober er belysning ikke en forudsætning. Og selv omvendt kan ultraviolet solenergi undertrykke deres udvikling.

3. Vand. Alle mikroorganismer har brug for vand i en tilgængelig (flydende) form. Det er grunden til, at frosne fødevarer har ringe eller ingen bakterievækst.

4. Surhed i miljøet. Dette princip om at dyrke bakterier er allerede blevet diskuteret i detaljer ovenfor.

5. Beluftning. Ilt, som et kemisk grundstof, er en integreret del af vand og et betydeligt antal forbindelser, der bruges tildyrkning af mikroorganismer. Gasformig oxygen kan også være indeholdt i vand og andre væsker i opløst form. En betydelig del af bakterierne har brug for en konstant tilførsel af iltmolekyler. Men for en række mikroorganismer er det unødvendigt, eller værre, gasformig oxygen er giftig for dem, da de ikke har katalase og peroxidase, som ødelægger giftige åndedrætsprodukter. Derfor er det vigtigste trin i dyrkningen af anaerobe bakterier fjernelse af O₂ molekyler fra næringsmediet.

6. Dyrkning af mikroorganismer. Dyrkning af aerobe og anaerobe bakterier udføres i forskellige lag af miljøet og på forskellige måder.

Dyrkning af aerobe mikroorganismer

Dyrkning af aerobe bakterier kræver molekylær oxygen. For at opnå rene kulturer af aerobe, som med succes kan bruges i medicin og fødevareindustrien, bruges følgende metoder:

• overflade vokser på tætte medier eller i flydende medier (deres tynde lag), når ilt kommer direkte fra luften;
• dyb dyrkning i flydende medier, når en stigning i mængden af ilt opløst i dem opnås ved konstant beluftning.

Dyrkning af anaerobe mikroorganismer

Det grundlæggende princip for at dyrke bakterier af denne type er deres minimale kontakt med atmosfærisk ilt. At give betingelser for deres vækst er meget vanskeligere end for aerobe. Følgende metoder bruges til at isolere anaerober fra molekylær O₂:

1. Fysisk. Denne metode til dyrkning af anaerobe bakterier reduceres til deres dyrkning i et specielt vakuumapparat - en mikroanaerostat. Luften i den er erstattet af en speciel gasblanding af nitrogen med tilsætning af 10 % brint og 5 % kuldioxid.
2. Kemisk. Disse omfatter: brug af absorberende midler (f.eks. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) eller reduktionsmidler (såsom ascorbinsyre).
3. Biologisk. Det handler om samdyrkning af aerober og anaerober i et lukket system. Denne metode til dyrkning af bakterier involverer såning af den ene halvdel af en petriskål med nogle af de aerobe bakteriearter og den anden halvdel med den undersøgte anaerobe. Dens udvikling vil begynde i det øjeblik, hvor al ilten er brugt op.

Følgende såningsmetoder er velegnede til at dyrke anaerobe bakterier:

• i overfladelaget;
• i overfladelaget fyldt med steril paraffin;
• i tykkelsen af et tæt næringsmedium;
• i dybe lag af tyktflydende medier.

Opnåelse af ren kultur

Mikrobiologer arbejder norm alt med prøver, der er beboet af mange forskellige typer mikrober. Men for at bestemme den systematiske position af mikroorganismer (familie, slægt, arter) samt for at studere deres egenskaber, er det nødvendigt at isolere dem og dyrke en ren kultur. De har stor betydning i mange fødevareindustrier, for eksempel ost, brød, kvas, vin osv. Dyrkning af mælkesyrebakterier gør det muligt at opnåen vigtig komponent til produktion af fermenterede mælkeprodukter, dej, kakao, ensilage og endda plastik.

Fremgangsmåden til isolering af en ren kultur i et tæt medium er baseret på mekanisk adskillelse af mikroorganismeceller med deres efterfølgende isolerede dyrkning. Prøven overføres til et sterilt volumen vand eller s altvand (volumen 10-100 ml) og rystes derefter i to minutter. For at udvinde mikroorganismer placeret i tykkelsen af det undersøgte materiale (for eksempel pølser eller ost), gnides prøvestykkerne først med sterile instrumenter med sand. Materialet, der har gennemgået forberedning, vejer 1 g eller et volumen på 1 ml, fortyndes med sterilt vand 10, 100, 1000 osv. gange. Den fortyndingsgrad er valgt, der giver en koncentration af celler svarende til metodens muligheder.

Den efterfølgende dyrkning af mikroorganismer er at forberede et næringsmedium. Norm alt vælges et tæt medium (MPA). Det smeltes først og afkøles til 45-50 °C, og først derefter hældes det i flere petriskåle (tre til fem stykker), på bunden af hvilke podninger fra teststoffet i forskellige koncentrationer placeres. Dernæst udføres blanding af det stadig ikke frosne næringsmedium og materialet, der indføres i det. Det er sådan, celler fikseres på forskellige punkter i substratets volumen.

Dernæst anbringes petriskåle i en termostat i 2 dage ved 22 °C. I løbet af denne tid formerer cellerne sig i en sådan grad, at kolonien dannet af hver af cellerne bliver synlig for det blotte øje. Hver af dem er en ren kultur af den type bakterier, fra hvis celler det errose.

Derefter subkultureres mikroorganismer fra petriskåle til separate reagensglas fyldt med et næringsmedium. På denne måde isoleres rene kulturer fra en blandet prøve. Denne metode bærer navnet på dens udvikler - R. Koch. Det kaldes også almindeligvis kopmetoden eller udtømmende såning. Efter opnåelse af rene kulturer af forskellige typer bakterier bestemmes deres form, sporer og familier.

Alt arbejde skal udføres i overensstemmelse med principperne for asepsis. For at undgå for tidlig udvikling af mikroorganismer bør undersøgelsen udføres umiddelbart efter prøveudtagning. Postevand analyseres efter aftapning af de første portioner, da de kan indeholde mikrober ophobet i rør og vandhaner. Mikrofloraen af frugter, bær og grøntsager er hovedsageligt placeret på overfladen (skræl), derfor udføres vask fra den. For at gøre dette skal du placere fosteret i en steril beholder og fylde den med den nødvendige mængde vand. Derefter rystes de ret kraftigt og vandet hældes i en anden beholder. Afgrøder fra tøjprodukter fås også i vatpinde, men på forhånd skæres stykker af en given størrelse ud af dem.