Gramfarvning er meget brugt i mikrobiologi, da det er en af de nemmeste måder at differentiere bakterier på baseret på sammensætningen af deres cellevæg. Ifølge Gram kan alle bakterier opdeles i gram-positive (Gram (+)) og gram-negative (Gram (-)). Gram-farvemetoden blev udviklet i 1884 og har ikke mistet popularitet siden da, selvom den er blevet ændret flere gange.
Cellevægsstruktur
Gramfarvning afslører, om en bakterie er Gram-positiv eller Gram-negativ. Opdelingen af bakterier i Gram (+) og Gram (-) udføres i overensstemmelse med strukturen af deres cellevæg.
Cellevæggen indeholder den største mængde peptidoglycan (murein) - et komplekst stof, som omfatter peptapeptid og glycan. Glykanen består af alternerende rester af N-acetylglucosamin og N-acetylmuraminsyre bundet til hinanden af β-1,4-glykosidbindinger. Peptidoglycan giver celleform vedligeholdelse, osmotisk beskyttelse og antigene funktioner.
Vigtigste forskelle mellem grampositive og gramnegative bakterier
Forskellige bakterier har forskellige peptidoglycan-lagtykkelser. I bakterier, der er klassificeret som gram-positive, varierer det fra 15 til 80 nm, mens det i gram-negative er fra 2 til 8 nm. Samtidig har Gram-negative bakterier en særlig struktur under peptidoglycanlaget, som Gram-positive bakterier ikke har - det periplasmatiske rum. Dette rum er fyldt med hydrolytiske enzymer - β-lactamase, ribonuklease 1, phosphatase. Det er disse enzymer, der er ansvarlige for gramnegative bakteriers resistens over for mange antibiotika.
Gram(-) peptidoglycanlaget af bakterier er bundet til lipopolysaccharid, en antigen struktur indeholdende endotoksin. I Gram(+)-bakterier udfører teichoinsyrer lignende funktioner.
Gram-negative bakterier har en ekstra struktur - den ydre membran.
essensen af farvningsmetoden
Før du begynder at farve, forberedes udstrygninger af de undersøgte bakterier. For at gøre dette dryppes vand på et objektglas, og en kultur af mikroorganismer tilsættes der med en bakteriel løkke. Derefter, efter at vandet er helt tørret, fikseres udstrygningen - glaspladen bæres flere gange over brænderens flamme. Gramfarvning er mere effektiv end farvning af levende bakterier - farvestofmolekyler binder bedre til døde celler.
Farvning udføres i flere trin:
- Små stykker filterpapir lægges på en fast smøre, og hovedfarven hældes - ensianviolet eller methylenblåt.
- Efter 3-5 minutter, fjern det farvede filterpapir og fyld smøringen med Lugols opløsning i 1 minut. I dette tilfælde bliver præparatet mørkere.
- Lugol-opløsningen drænes, og udstrygningen behandles med ren ethylalkohol: nogle få dråber dryppes på præparatet, drænes efter 20 sekunder. Proceduren gentages 2-3 gange.
- Skyl testglasset med destilleret vand.
- Fremstil yderligere farvning - afslut forberedelsen med fuchsin. Efter 1-2 minutter vaskes farven af.
- Efter vandet er tørret, undersøges udstrygningen under et mikroskop. Gram-positive bakterier vil være blå-violette, Gram-negative bakterier vil være lyserøde eller røde.
Årsager til forskellige farvningsmønstre
Som beskrevet ovenfor farver gram-farvning af bakterier gram-positive bakterier blå-violette, mens gram-negative bakterier farves rødt eller lyserødt. Årsagen til den differentielle farvning af bakterier ved denne metode er, at efter at den opløselige form af ensianviolet kommer ind i cellen, går farvestoffet over i den uopløselige jodform. Under behandlingen af bakterier med ethylalkohol ekstraheres lipider fra membranen under påvirkning af dette ikke-polære opløsningsmiddel. Membranen bliver derefter porøs og er ikke længere en væsentlig barriere for farveudvaskning. Imidlertidpeptidoglycan er mere modstandsdygtig over for ikke-polære opløsningsmidler, herunder alkohol. Det er ham, der forhindrer udvaskningen af farvestoffet, så bakterier med et tykt murein-lag bliver blåviolette (gram-positive), og efter behandling med alkohol ændrer de ikke farve.
Tyndt murein-lag af gramnegative bakterier kan ikke holde farvestofmolekylerne i cellen, så efter alkoholpåvirkning bliver de farveløse - farves gramnegative.
Efter eksponering af en udstrygning for fuchsin forbliver gramfarvede bakterier blåviolette, mens gramnegative bakterier bliver pink-røde.
Eksempler på Gram(+)- og Gram(-)-bakterier
Gram-negative bakterier omfatter cyanobakterier, svovlbakterier, jernbakterier, klamydia, rickettsia, eddikesyrebakterier, mange methylobakterier, thioniske bakterier, arsenitobakterier, carboxybakterier.
Bifidobakterier, mange akvatiske bakterier, streptokokker og stafylokokker er grampositive.
