Hvad ligger til grund for DNA-hybridisering? Selvom den dobbeltstrengede DNA-sekvens generelt er stabil under fysiologiske forhold, vil ændring af disse forhold i laboratoriet (typisk ved at hæve den omgivende temperatur) få molekylerne til at adskilles i individuelle strenge. Sidstnævnte er komplementære til hinanden, men kan også komplementere andre sekvenser til stede i deres miljø. Sænkning af den omgivende temperatur tillader de enkeltstrengede molekyler at anneale eller "hybridisere" med hinanden. Dette er DNA-hybridiseringsmetoden.
Konceptet fra molekylærbiologiens synspunkt
Forskere, der er involveret i både DNA-replikation og transkription af DNA til RNA, er afhængige af nukleotidoverkrydsninger og molekylærbiologiske teknikker. Dette inkluderer Southern og Northern blots, polymerasekædereaktion (PCR) og de fleste DNA-RNA-hybridiserings- og sekventeringsmetoder.
Application
Hybridisering er nukleotidets hovedegenskabsekvenser og bruges i adskillige metoder inden for molekylærbiologi. Det overordnede genetiske forhold mellem to arter kan bestemmes ved at hybridisere segmenter af deres DNA (DNA-DNA hybridisering). På grund af sekvensligheder mellem nært beslægtede organismer kræves der en højere temperatur for at smelte sådanne DNA-hybrider sammenlignet med fjernere organismer. Forskellige metoder bruger hybridisering til at bestemme oprindelsen af en DNA-prøve, herunder polymerasekædereaktionen (PCR). I en anden metode hybridiseres korte DNA-sekvenser til cellulært mRNA for at identificere udtrykte gener. Farmaceutiske virksomheder udforsker brugen af antisense RNA til at binde til uønsket mRNA, hvilket forhindrer ribosomet i at omsætte mRNA til protein.
DNA-DNA-hybridisering refererer generelt til en molekylærbiologisk teknik, der måler graden af genetisk lighed mellem puljer af DNA-sekvenser. Det bruges almindeligvis til at bestemme den genetiske afstand mellem to organismer. Det har været meget brugt i fylogeni og taksonomi.
Metode
DNA fra én organisme blev mærket og derefter blandet med umærket DNA, der kunne sammenlignes med det. Blandingen inkuberes for at tillade DNA-strengene at dissociere og derefter afkøles til dannelse af et regenereret hybridt dobbeltstrenget DNA. Hybridiserede sekvenser med en høj grad af lighed vil binde tættere og kræve mere energi for at adskille dem: dvs. de adskilles, når de opvarmes til en højeretemperatur end uens sekvenser, en proces kendt som "DNA-smeltning".
DNA-smeltning
Ved evaluering af det hybridiserede DNA's smelteprofil bindes det dobbeltstrengede DNA til en såkaldt "søjle", og den resulterende blanding opvarmes. Ved hvert trin vaskes søjlen, og DNA-sekvenserne, der smelter, bliver enkeltstrengede og vaskes af søjlen. Temperaturerne, ved hvilke mærket DNA forlader søjlen, afspejler mængden af lighed mellem sekvenser (og det selvfoldende mønster tjener som en kontrol). Disse resultater kombineres for at bestemme graden af genetisk lighed mellem organismer. Ifølge moderne mikrobiologi er DNA-hybridisering umulig uden at forstå disse ting.
Når flere arter af ribonukleinsyre (eller deoxyribonukleinsyre) sammenlignes på denne måde, gør lighedsværdierne det muligt for arten at blive placeret i det fylogenetiske træ. Derfor er dette en af de mulige tilgange til at udføre molekylær systematik. Charles Sibley og John Ahlquist, pionererne inden for denne teknik, brugte DNA-DNA-hybridisering til at studere de fylogenetiske forhold mellem fugle (Sibley-Ahlquist-taksonomi) og primater.
Betydning for biologi
DNA-DNA-hybridisering er guldstandarden for at skelne bakteriearter, med en lighedsværdi på mere end 70 %, hvilket indikerer, at de sammenlignede stammer tilhører forskellige arter. I 2014 blev der foreslået en tærskel på 79 % lighed for at adskille en bakteriel underart.
Kritikere hævder, at teknikken er unøjagtig til at sammenligne nært beslægtede arter, da ethvert forsøg på at måle forskelle mellem orthologe sekvenser mellem organismer overvældes af hybridiseringen af paraloge modstykker i en organismes genom. DNA-sekventering og beregningsmæssige sekvenssammenligninger er i øjeblikket den almindeligt anvendte metode til at bestemme genetisk afstand, selvom denne tilgang stadig bruges i mikrobiologi til at hjælpe med at identificere bakterier.
Den nuværende måde er at udføre DNA-DNA-hybridisering i silikone ved hjælp af helt eller delvist sekventerede genomer. GGDC udviklet af DSMZ er det mest nøjagtige kendte værktøj til beregning af DDH-lignende værdier. Blandt andre algoritmiske forbedringer løser den problemet med paralogiske sekvenser ved omhyggeligt at filtrere dem fra match mellem to genomsekvenser.
FISH-metode
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) er en laboratorieteknik, der bruges til at detektere og sekventere DNA, ofte på et specifikt kromosom.
I 1969 udgav Joseph Gall og Mary Lou Pardu et papir, der demonstrerede, at radioaktive kopier af en ribosomal DNA-sekvens kunne bruges til at påvise komplementære DNA-sekvenser i kernen af et frøæg. Siden disse originale observationer har mange forbedringer øget alsidigheden ogfølsomheden af proceduren i en sådan grad, at in situ hybridisering ("på plads", latin) nu betragtes som et vigtigt værktøj i cytogenetik. (Udtrykket in situ bruges nu også til at henvise til den indledende fase af carcinomvækst, hvor kun epitelvæv er involveret i den patologiske proces.)
Fluorescerende hybridiseringssekvens
RNA-prober kan designes til ethvert gen eller enhver sekvens i et gen for at visualisere lncRNA og miRNA mRNA i væv og celler. FISH bruges til at studere celle-reproduktionscyklussen, især nuklear interfase for eventuelle kromosomale abnormiteter. FISH giver dig mulighed for at analysere en stor række af arkivsager, det er meget nemmere at identificere det identificerede kromosom ved at skabe en sonde med en kunstig kromosombase, der vil tiltrække lignende kromosomer.
Hybridiseringssignaler for hver probe, når en nuklear abnormitet detekteres: hver mRNA- og lncRNA-detektionsprobe består af 20 par oligonukleotider, hvert par dækker et rum på 40-50 bp. s. Prober bruger proprietær kemi til at detektere mRNA.
Hybridisering med DNA-prober
Prober er ofte lavet af DNA-fragmenter, der er blevet isoleret, oprenset og amplificeret til brug i design af det menneskelige genom. Størrelsen af det menneskelige genom er så stor sammenlignet med den længde, der kan sekventeres direkte, at det er nødvendigt at opdele det ifragmenter. I sidste ende blev disse fragmenter ordnet ved at fordøje en kopi af hvert fragment til endnu mindre enheder ved hjælp af sekvensspecifikke endonukleaser for at måle størrelsen af hvert lille fragment ved hjælp af størrelsesudelukkelseskromatografi ved hjælp af denne information til at bestemme, hvor store fragmenter overlappede hinanden..
For at bevare grundstofferne med deres individuelle DNA-sekvenser blev fragmenterne tilføjet til et system af stadigt gentagne bakteriepopulationer. Klonale populationer af bakterier, hvor hver population opretholder et enkelt kunstigt kromosom, opbevares i forskellige laboratorier rundt om i verden. Kunstige kromosomer (BAC'er) kan dyrkes, ekstraheres og mærkes i ethvert laboratorium, der indeholder et bibliotek. Genomiske biblioteker er ofte opkaldt efter de institutioner, hvor de blev udviklet. Et eksempel er RPCI-11 biblioteket, opkaldt efter Roswell Cancer Institute i Buffalo (New York, USA). Disse fragmenter udgør omkring 100 tusinde basepar og er grundlaget for de fleste FISH-prober.
