Når man studerer stoffer i organisk kemi, bruges mere end et dusin forskellige kvalitative reaktioner til at bestemme indholdet af visse forbindelser. En sådan visuel analyse giver dig mulighed for straks at forstå, om de nødvendige stoffer er til stede, og hvis de ikke er til stede, kan du reducere yderligere eksperimenter betydeligt for at identificere dem. Disse reaktioner omfatter ninhydrin, som er den vigtigste i den visuelle bestemmelse af aminoforbindelser.
Hvad er det her?
Ninhydrin er en dicarbonylforbindelse, der indeholder en aromatisk ring med en heterocyklisk ring knyttet til sig, hvis andet atom har 2 hydroxylgrupper (OH-). Dette stof opnås ved direkte oxidation af inandion - 1, 3, og derfor har det ifølge den internationale nomenklatur følgende navn: 2, 2 - dihydroxyinandion -1, 3 (fig. 1).
Ren ninhydrin er en gul eller hvid krystalfarver, der ved opvarmning opløses godt i vand og andre polære organiske opløsningsmidler, såsom acetone. Dette er et ret skadeligt stof, hvis det kommer i kontakt med huden i store mængder eller slimhinder, forårsager det irritation, også ved indånding. Arbejde med denne forbindelse bør være forsigtig og kun med handsker, da den, når den kommer i kontakt med huden, reagerer med hudcelleproteiner og pletter den lilla.
Reaktive stoffer
Som nævnt ovenfor bruges ninhydrinreaktionen primært til visuel bestemmelse af indholdet af aminoforbindelser:
- α-aminosyrer (inklusive i proteiner);
- aminosukker;
- alkaloider, der indeholder –NH2 og -NH-grupper;
- diverse aminer.
Det skal bemærkes, at sekundære og tertiære aminer nogle gange reagerer meget svagt, så der er behov for mere forskning for at bekræfte deres tilstedeværelse.
Forskellige metoder til kromatografi anvendes til kvantitativ bestemmelse, for eksempel papirkromatografi (BC), tyndtlagskromatografi (TLC) eller med vask af faste bærere med en opløsning af ninhydrin i forskellige medier.
Denne reaktion er ikke specifik for aminoforbindelser, da reagenset kan indgå i den på én gang. Men fra reaktionsprodukternes side har det en ejendommelighed i form af frigivelse af kuldioxidbobler (CO2), og dette er kun typisk, når det interagerer med α-amino syrer.
Mekanismefunktioner
BDer er forskellige fortolkninger af ninhydrin-reaktionsligningen i litteraturen. Nogle forskere udelader dannelsen af hydrindanthin fra 2-aminoinandion, som med deltagelse af ammoniak og ninhydrin også danner et farvestof kaldet "Ruemans lilla" (eller "Ruemans blå"), mens andre tværtimod kun antager dens deltagelse uden tilstedeværelse af mellemliggende aminoprodukter. Der er også nogle interessante punkter i registreringen af selve reaktionen, især vedrører dette metoderne til at binde aminoderivatet af ninhydrin til dets hovedmolekyle for at danne et farvestof. Angivelsen af stedet for "vandrende hydrogen" opnået af den mellemliggende amin fra det vandige medium er også tvivlsom: den kan enten være i ketongruppen eller ved siden af –NH2.
I virkeligheden er nuancen med H-atomet ubetydelig, da dets position i forbindelsen ikke spiller en særlig rolle i reaktionsforløbet, så det skal man ikke være opmærksom på. Hvad angår udeladelsen af et af de mulige stadier, ligger årsagen her i det teoretiske aspekt: indtil nu er den nøjagtige mekanisme for dannelsen af Ruemans lilla ikke blevet præcist bestemt, så der kan findes helt forskellige skemaer for ninhydrinreaktionen.
Det mest fuldstændige mulige interaktionsforløb mellem reagenset og aminoforbindelser vil blive foreslået nedenfor.
Reaktionsmekanisme
For det første interagerer ninhydrin med α-aminosyre, vedhæfter den på stedet for sp altning af hydroxygrupper og danner et kondensationsprodukt (fig. 2a). Derefter ødelægges sidstnævnte og frigiver mellemproduktet amin, aldehyd og kuldioxid (fig. 2b). Fra det endelige produkt ved tilslutningninhydrin, syntetiseres Rueman-lilla strukturen (diketonhydrindenketohydrinamin, fig. 2c). Også angivet er den mulige dannelse af hydrindanthin (reduceret ninhydrin) fra den mellemliggende amin, som også bliver til en farvestof i nærværelse af ammoniak (mere præcist, ammoniumhydroxid) med et overskud af selve reagenset (fig. 2d).
Dannelsen af hydrindantin blev bevist af Rueman selv, når svovlbrinte virker på ninhydrin-molekylet. Denne forbindelse er i stand til at opløses i natriumcarbonat Na2CO3, hvorved opløsningen farves mørkerød. Og når fortyndet s altsyre tilsættes, udfældes hydrindanthin.
Sandsynligvis er den mellemliggende amin, hydridanthin, ninhydrin og farvestoffets struktur, på grund af deres ustabilitet ved opvarmning, i en vis ligevægt, hvilket muliggør tilstedeværelsen af flere yderligere stadier.
Denne mekanisme er velegnet til at forklare ninhydrin-reaktionen med andre aminoforbindelser, med undtagelse af biprodukter, der er et resultat af eliminering af resten af strukturen fra –NH2, -NH eller -N.
Biuret-test og andre reaktioner på proteiner
Kvalitativ analyse for peptidbindinger, selv af ikke-proteinstrukturer, kan ikke kun finde sted under deltagelse af ovenstående reagens. Men i tilfælde af en ninhydrinreaktion til proteiner, sker interaktionen ikke langs -CO-NH-grupper, men langs amingrupper. Der er en såkaldt "biuret reaktion", som er karakteriseret ved tilsætning af ioner til opløsningen med aminoforbindelserbivalent kobber fra CuSO4 eller Cu(OH)2 i et alkalisk medium (fig. 3).
Under analysen, i nærværelse af de nødvendige strukturer, bliver opløsningen mørkeblå på grund af bindingen af peptidbindinger til et farvekompleks, som adskiller et reagens fra et andet. Det er grunden til, at biuret- og ninhydrinreaktionerne er universelle i forhold til protein- og ikke-proteinstrukturer med –CO-NH‒-gruppen.
Ved bestemmelse af cykliske aminosyrer anvendes en xantoproteinreaktion med en koncentreret opløsning af salpetersyre HNO3 , som giver en gul farve ved nitrering. En dråbe reagens på huden udviser også en gul farve ved at reagere med aminosyrerne i hudcellerne. Salpetersyre kan forårsage forbrændinger og bør også håndteres med handsker.
Eksempler på interaktion med aminoforbindelser
Ninhydrinreaktion for α-aminosyrer giver et godt visuelt resultat, bortset fra farven prolin og hydroxyprolin strukturer, som reagerer med dannelsen af en gul farve. En mulig forklaring på denne effekt blev fundet i andre miljøforhold for vekselvirkningen mellem ninhydrin og disse strukturer.
Reaktion med aminogruppe
Da testen ikke er specifik, er visuel påvisning af alanin ved hjælp af ninhydrinreaktionen i blandingen ikke mulig. Men ved papirkromatografi, når man påfører prøver af forskellige α-aminosyrer, sprøjter dem med en vandig opløsning af ninhydrin og fremkalder i et specielt medium, kan manberegne den kvantitative sammensætning af ikke kun den påberåbte forbindelse, men også mange andre.
Skematisk følger interaktionen mellem alanin og ninhydrin det samme princip. Det hæfter til reagenset ved amingruppen, og under påvirkning af aktive hydroniumioner (H3O+) sp altes det ved kulstoffet -nitrogenbinding, nedbrydes til acetaldehyd (CH3COH) og kuldioxid (CO2). Et andet ninhydrinmolekyle binder sig til nitrogen og fortrænger vandmolekyler, og der dannes en farvende struktur (fig. 4).
Reaktion med en heterocyklisk aminoforbindelse
Ninhydrinreaktionen med prolin er specifik, især i kromatografiske analyser, eftersom sådanne strukturer i et surt medium først bliver gule og derefter bliver lilla i et neutr alt. Forskerne forklarer dette med et træk ved cyklus-omlejringen i den mellemliggende forbindelse, som netop påvirkes af tilstedeværelsen af et stort antal brintprotoner, der komplementerer det eksterne energiniveau af nitrogen.
Ødelæggelsen af heterocyklussen sker ikke, og et andet ninhydrinmolekyle er knyttet til det ved det 4. carbonatom. Ved yderligere opvarmning bliver den resulterende struktur i et neutr alt medium til Rueman lilla (fig. 5).
Forberedelse af hovedreagenset
Ninhydrintest udføres med forskellige opløsninger, afhængigt af opløsningen af aminostrukturer i visse organiske oguorganiske forbindelser.
Hovedreagenset er fremstillingen af en 0,2 % opløsning i vand. Dette er en alsidig blanding, da de fleste forbindelser opløses godt i H2O. For at opnå et frisklavet reagens fortyndes en prøve på 0,2 g kemisk ren ninhydrin i 100 ml vand.
Det er værd at bemærke, at for nogle analyserede opløsninger er denne koncentration utilstrækkelig, så 1 % eller 2 % opløsninger kan fremstilles. Dette er typisk for ekstrakter fra medicinske råvarer, da de indeholder forskellige klasser af aminoforbindelser.
Når der udføres kromatografiske undersøgelser, kan opløsninger, for eksempel ved vask af en blanding på en fast bærer gennem en søjle, fremstilles i alkohol, dimethylsulfoxid, acetone og andre polære opløsningsmidler - alt vil afhænge af opløsningsmidlet af visse aminostrukturer.
Application
Ninhydrin-reaktionen gør det muligt at påvise mange aminoforbindelser i opløsning, hvilket gjorde den til en af de første, der blev brugt i den kvalitative analyse af organiske stoffer. Visuel bestemmelse reducerer antallet af eksperimenter markant, især når man analyserer dårligt undersøgte planter, lægemidler og doseringsformer samt ukendte løsninger og blandinger.
Inden for retsmedicin er denne metode meget brugt til at bestemme tilstedeværelsen af svedmærker på enhver overflade.
Selv på trods af reaktionens uspecificitet, er det umuligt at trække ninhydrinreaktionen ud af kemisk praksis, daudskiftning af dette stof med mindre toksiske analoger (f.eks. oxolin) viste, at de har dårligere følsomhed over for aminogrupper og ikke giver gode resultater i fotometriske analyser.
