Absorption og yderligere re-emission af lys af uorganiske og organiske medier er resultatet af phosphorescens eller fluorescens. Forskellen mellem fænomenerne er længden af intervallet mellem lysabsorption og emission af strømmen. Med fluorescens forekommer disse processer næsten samtidigt og med phosphorescens med nogen forsinkelse.
Historisk baggrund
I 1852 beskrev den britiske videnskabsmand Stokes første gang fluorescens. Han opfandt det nye udtryk som et resultat af sine eksperimenter med flusspat, som udsendte rødt lys, når det blev udsat for ultraviolet lys. Stokes bemærkede et interessant fænomen. Han fandt ud af, at bølgelængden af fluorescerende lys altid er længere end for excitationslyset.
Mange eksperimenter blev udført i det 19. århundrede for at bekræfte hypotesen. De viste, at en række prøver fluorescerer, når de udsættes for ultraviolet lys. Materialer inkluderet blandt andet krystaller, harpiks, mineraler, klorofyl,medicinske råvarer, uorganiske forbindelser, vitaminer, olier. Den direkte brug af farvestoffer til biologisk analyse begyndte først i 1930
Fluorescensmikroskopibeskrivelse
Nogle af de materialer, der blev brugt til forskning i første halvdel af det 20. århundrede, var meget specifikke. Takket være indikatorer, der ikke kunne opnås med kontrastmetoder, er fluorescensmikroskopimetoden blevet et vigtigt redskab i både biomedicinsk og biologisk forskning. De opnåede resultater var af ikke ringe betydning for materialevidenskab.
Hvad er fordelene ved fluorescensmikroskopi? Ved hjælp af nye materialer blev det muligt at isolere meget specifikke celler og submikroskopiske komponenter. Et fluorescerende mikroskop giver dig mulighed for at detektere individuelle molekyler. En række farvestoffer giver dig mulighed for at identificere flere elementer på samme tid. Selvom udstyrets rumlige opløsning er begrænset af diffraktionsgrænsen, som igen afhænger af prøvens specifikke egenskaber, er påvisningen af molekyler under dette niveau også ganske mulig. Forskellige prøver udviser autofluorescens efter bestråling. Dette fænomen er meget udbredt i petrologi, botanik, halvlederindustrien.
Funktioner
Undersøgelsen af dyrevæv eller patogene mikroorganismer kompliceres ofte af enten for svag eller meget stærk ikke-specifik autofluorescens. Dog er værdien iforskning erhverver introduktionen i materialet af komponenter, der exciteres ved en bestemt bølgelængde og udsender en lysstrøm med den nødvendige intensitet. Fluorochromer fungerer som farvestoffer, der er i stand til at binde sig selv til strukturer (usynlige eller synlige). Samtidig er de kendetegnet ved høj selektivitet med hensyn til mål og kvanteudbytte.
Fluorescensmikroskopi er blevet meget brugt med fremkomsten af naturlige og syntetiske farvestoffer. De havde specifikke emissions- og excitationsintensitetsprofiler og var rettet mod specifikke biologiske mål.
Identifikation af individuelle molekyler
Ofte, under ideelle forhold, kan du registrere gløden af et enkelt element. For at gøre dette er det blandt andet nødvendigt at sikre tilstrækkelig lav detektorstøj og optisk baggrund. Et fluorescein-molekyle kan udsende op til 300.000 fotoner før ødelæggelse på grund af fotoblegning. Med en indsamlingsprocent på 20 % og proceseffektivitet kan de registreres i et beløb på omkring 60 tusind
Fluorescensmikroskopi, baseret på lavinefotodioder eller elektronmultiplikation, gjorde det muligt for forskere at observere individuelle molekylers adfærd i sekunder og i nogle tilfælde minutter.
Vanskeligheder
Nøgleproblemet er støjundertrykkelse fra den optiske baggrund. På grund af det faktum, at mange af de materialer, der anvendes i konstruktionen af filtre og linser, udviser en vis autofluorescens, var videnskabsmænds indsats i de indledende faser fokuseret på at udstedekomponenter med lav fluorescens. Imidlertid førte efterfølgende eksperimenter til nye konklusioner. Især har fluorescensmikroskopi baseret på total intern refleksion vist sig at opnå lav baggrund og høj excitationslysoutput.
Mekanisme
Principperne for fluorescensmikroskopi baseret på total intern refleksion er at bruge en hurtigt henfaldende eller ikke-udbredende bølge. Det opstår ved grænsefladen mellem medier med forskellige brydningsindekser. I dette tilfælde passerer lysstrålen gennem et prisme. Den har et højt brydningsindeks.
Prismet støder op til en vandig opløsning eller glas med lav parameter. Hvis lysstrålen rettes mod den i en vinkel, der er større end den kritiske, reflekteres strålen fuldstændigt fra grænsefladen. Dette fænomen giver til gengæld anledning til en ikke-udbredende bølge. Der genereres med andre ord et elektromagnetisk felt, der trænger ind i et medium med et lavere brydningsindeks i en afstand på mindre end 200 nanometer.
I en ikke-udbredende bølge vil lysintensiteten være ganske tilstrækkelig til at excitere fluoroforer. Men på grund af dens usædvanligt lave dybde vil dens volumen være meget lille. Resultatet er en baggrund på lavt niveau.
Ændring
Fluorescensmikroskopi baseret på total intern refleksion kan realiseres med epi-belysning. Dette kræver linser med øget numerisk blænde (mindst 1,4, men det er ønskeligt, at det når 1,45-1,6), samt et delvist oplyst felt af apparatet. Sidstnævnte opnås med en lille plet. For større ensartethed anvendes en tynd ring, gennem hvilken en del af flowet er blokeret. For at opnå en kritisk vinkel, hvorefter total refleksion opstår, er det nødvendigt med et højt brydningsniveau af nedsænkningsmediet i linserne og mikroskopets dækglas.